ПЦР-исследования

Одним из способов диагностики различных инфекционных заболеваний является ПЦР-исследование. Это метод полимеразной цепной реакции, с помощью которого можно идентифицировать различные микроорганизмы, даже если они присутствуют в очень малых количествах.

Именно ПЦР сегодня признан «золотым стандартом» для обнаружения новой коронавирусной инфекции. Также метод активно применяется для диагностики вирусных, хламидийных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций. Такое широкое распространение процедуры связано с высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет добиться точности в 99% случаев.

Суть метода

Впервые методика полимеразной цепной реакции была использована почти 30 лет назад. Практически сразу исследование стало одним из основных способов диагностики инфекционных заболеваний. В 1993 году создатель анализа был награжден Нобелевской премией за огромный вклад в развитие всей мировой медицины.

Каждый живой организм имеет уникальный набор хромосом. В том числе это касается вирусов, грибов и других возбудителей различных заболеваний. Все хромосомы образованы ДНК. Дезоксирибонуклеиновая кислота представляет собой биологический полимер, который обеспечивает хранение, передачу и реализацию генов. ДНК хранит в клетках информацию о структуре РНК и белков. Состоит из множества молекул, называемых нуклеотидами.

РНК – это рибонуклеиновая кислота, еще один вид биологического полимера, который по своему химическому строению близок к ДНК. Молекула РНК также состоит из множества звеньев – нуклеотидов. Именно РНК является носителем генетической информации у ряда вирусов. Кроме этого, рибонуклеиновая кислота выполняет передачу данных от ДНК к белку.

Последовательность цепочек нуклеотидов, который содержатся в РНК и ДНК, образуют гены. Эта последовательность всегда уникальна, за исключением некоторых схожих участков ДНК, которые отвечают за однообразие в пределах одного вида. При помощи методики ПЦР можно найти даже мельчайшие фрагменты нуклеиновой кислоты, чтобы определить, к какому виду принадлежит микроорганизм.

Однако анализ ДНК небольшого количества микробов достаточно мало информативен, из-за чего требуется увеличить количество нуклеотидов. Именно с этими целями используется ПЦР, позволяющий многократно дублировать цепочку нуклеотидов.

Катализатором такого процесса выступают нити РНК, они крепятся к изучаемому гену. В результате всего за несколько часов из одного фрагмента можно получить достаточно биологического материала для изучения.

Информация о ДНК и РНК, которые в настоящее время изучаются, хранится в научных базах данных лабораторий. После изобретения метода ПЦР были изучены и зафиксированы уникальные нуклеотидные последовательности (праймеры длиной 15-30 штук), характерные только для конкретного патогена. Если поместить такие праймеры в пробирку с исследуемым материалом, в котором есть ДНК или РНК «живых» патогенов, начнется реакция репликации – создание большого количества копий, которые можно визуально идентифицировать. То есть начинается процесс многократного копирования ДНК / РНК.

И при расчете результатов сотрудники лаборатории могут определить, присутствуют ли в исследуемом образце определенные бактерии и вирусы, поэтому результаты анализа в основном качественные.

Метод ПЦР строго специфичен и при правильном выполнении не может дать ложноположительного результата. То есть, если инфекции нет, анализ никогда не покажет, что она есть. Поэтому очень часто ПЦР-анализ проводится дополнительно для подтверждения диагноза, а также для того, чтобы определить патоген и его природу.

Преимущества и недостатки

На сегодняшний день ПЦР считается наиболее информативным способом определения возбудителей инфекционных заболеваний.

Диагностика с помощью этого метода позволяет найти возбудителя, присутствующего в исследуемых материалах. Это – наиболее точный анализ на половые инфекции, скрытые инфекции и другие заболевания, передающиеся половым путем. Кроме этого, с помощью ПЦР сегодня определяется наличие коронавируса и ряда других инфекционных болезней, которые передаются воздушно-капельным путем. Полимеразная цепная реакция является эффективным диагностическим инструментом, который позволяет врачу не только точно определить тип инфекционного возбудителя в организме пациента, но и выявить количество патогенов. Эта помогает обнаруживать хронические инфекции, например, вирусный гепатит.

Отличие ПЦР-диагностики от других методик лабораторных исследований заключается в следующем:

• Метод направлен на идентификацию самого возбудителя.
• Диагностика универсальна и может использоваться для выявления нескольких патогенов.
• Для точной диагностики достаточно только одного биологического образца пациента.
• Метод обладает высокой чувствительностью и не сопровождается другими перекрестными реакциями.

Для анализа подходит любой биологический материал пациента: возможно изучение мазка, мочи, спермы и т. д.

Если говорить о других преимуществах методики, то можно отметить следующее:

• Специфичность. ПЦР позволяет идентифицировать ДНК вируса или бактерии со 100% точностью, чего не дает ни один другой метод диагностики.
• Чувствительность. Благодаря процедуре может быть обнаружена и идентифицирована даже небольшая часть ДНК или РНК.
• Эффективность. Поставить диагноз на основании полимеразной цепной реакции можно через 48 часов после сдачи биологического материала, что дает возможность своевременно начать лечение.
• Возможность количественного анализа. Эта характеристика важна при выявлении заболеваний, вызываемых условно патогенной микрофлорой (например, кандидоза).

К недостаткам ПЦР-диагностики можно отнести необходимость в высокотехнологичном оборудовании и высококвалифицированных специалистах. Кроме этого, из-за крайне высокой чувствительности есть риск неверного результата, если пациент инфицирован сразу несколькими видами микроорганизмов.

Специфичность и применение

Анализ методом полимеразной цепной реакции стал «золотым стандартом» для выявления ряда инфекций. Сегодня можно говорить о том, что такое исследование проверено временем, а строгие клинические испытания только подтвердили его эффективность и точность. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в образце присутствует всего несколько молекул ДНК.

ПЦР диагностирует наличие патогенов, которые растут в течение длительного времени, не прибегая к трудоемким процедурам, что особенно важно в гинекологии и урологии (при выявлении различных урогенитальных инфекций, передающихся половым путем).

Специфичность ПЦР достигает 100% для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и многих других бактериальных инфекций. Такой анализ позволяет обнаружить даже одну бактериальную или вирусную клетку, что зачастую невозможно при использовании других иммунологических, бактериологических или микроскопических методик.

Метод эффективен даже для форм микроорганизмов, которые трудно диагностировать или невозможно культивировать в лабораториях. Именно поэтому процедуру часто применяют для обнаружения скрытых и хронических инфекций.

В основе специфичности такого анализа – образование комплементарных комплексов между матрицей и праймерами – небольшими синтетическими нуклеотидами. В результате этого каждая из таких частей комплементарна с одной из цепей двуцепочечной матрицы, то есть позволяет выявить начало и конец участка.

Метод обладает высокой антигенной изменчивостью, поэтому очень эффективен для выявления внутриклеточных микроорганизмов. С помощью метода ПЦР можно обнаружить патогены не только в полученном клиническом материале от пациента, но даже в мазке с поверхностей и т. д. Поэтому методика имеет широкую сферу применения.

Очень часто ПЦР-анализ проводится для диагностики урологических и гинекологических заболеваний. Например, для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, ВПЧ (вируса папилломы человека). Другая область применения – для дифференциальной диагностики в пульмонологии. В том числе, с помощью процедуры выявляется вирусная и бактериальная пневмония, туберкулез. В гастроэнтерологии анализ служит для выявления геликобактериоза. При диагностике инфекционных заболеваний ПЦР используется как быстрый метод выявления сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов. Также методика эффективно используется в гематологии – для обнаружения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

Анализ ПЦР позволяет выявить различные скрытые инфекции, включая:

• гепатит;
• уреаплазмоз;
• микоплазмоз;
• кандидоз (молочница);
• хламидиоз;
• трихомониаз;
• папилломавирусная инфекция;
• герпес;
• бактериальный вагиноз;
• инфекционный мононуклеоз;
• ВИЧ.

С помощью ПЦР в режиме реального времени и оценки вирусной нагрузки врачи могут составить мнение о динамике заболевания и реакции на лечение. Это особенно актуально для пациентов с ВИЧ и другими серьезными заболеваниями.

Кроме этого, благодаря ПЦР можно безопасно идентифицировать коклюш, возбудителей ОРВИ. Также за счет анализа уточняется тип вируса гриппа и коронавируса, которые распространены в определенном регионе. Исходя из того, что можно разработать эффективную вакцину для каждого типа заболевания.

ПЦР позволяет определить тип возбудителя кишечной инфекции и, следовательно, назначить адекватное лечение. Также анализ становится незаменимым для определения возможного источника инфекции. Летом ПЦР-диагностика важна для выявления боррелиоза (болезни Лайма) и клещевого энцефалита.

Кроме этого, исследование методом ПЦР активно применяется в криминалистике и судебной медицине, генной инженерии, антропологии и палеонтологии. Методика позволяет установить степень родства, клонировать ДНК, определить мутагенез и т. д. В сельском хозяйстве исследование применяется для диагностики наследственных заболеваний домашних и сельскохозяйственных животных, обнаружения патогенов у растений, анализа продуктов на содержание генетических модификаций.

Виды ПЦР

Исследование имеет несколько разновидностей, которые активно применяются в лабораторной диагностике:

• С обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР,RT-PCR). Такая разновидность метода представляет собой амплификацию специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты. То есть одноклеточную РНК при помощи реакции обратной транскрипции превращают в комплементарную ДНК. Это позволяет выделить и определить известную последовательность из базы РНК.
• ПЦР (ОТ-ПЦР) в реальном времени. Это количественный метод исследования, так как он позволяет обнаружить нуклеотидную последовательность и измерить количество ее копий. То есть за счет этого можно понять количество исходных матриц ДНК или РНК.
• Иммуно-ПЦР в реальном времени. ПЦР позволяет определить наличие нуклеиновых кислот, однако зачастую нужно выявить ферменты, гормоны, токсины, антитела и пр. А для этого традиционно применяется иммуноферментный анализ (ИФА), который не определяет отдельные молекулы. Именно поэтому потребовалось соединить две методики – ПЦР и ИФА, в результате чего получился такой метод.

Также существуют другие разновидности исследований, которые используются в тех или иных случаях. Кроме этого, есть несколько вариантов проведения реакции. Наиболее популярные и эффективные из них:

• ПЦР с горячим стартом. В этом случае непосредственно перед запуском реакции в приборку добавляют полимеразу в комплексе с антителами, блокирующими ее активность. Это позволяет снизить вероятность получения неспецифически амплифицированных фрагментов.
• Ступенчатая ПЦР. В этом случае первые циклы реакции выполняются при повышенной температуре, постепенно происходит снижение до оптимальной. В результате этого удается снизить вероятность неспецифичной амплификации и добиться успешного конкурирования копий за праймеры.
• Холодная ПЦР. Такая разновидность применяется в тех случаях, когда необходимо выявить однонуклеотидную мутацию гена, но при этом в пробе содержится ДНК-матрица как с мутантным геном, так и с геном «дикого типа».
• Мультиплексная ПЦР. Такой вариант исследования позволяет определить сразу несколько последовательностей нуклеотидов. В одну пробирку с полученной ДНК-матрицей добавляют целый набор праймеров, в результате чего выполняется одновременная амплификация нескольких фрагментов.
• Асимметричная ПЦР. Реакция подобного типа выполняется в том случае, если нужно получить амплифицированную копию участка только одной из цепей ДНК.
• Инвертированная ПЦР. Используется в тех случаях, когда известен один участок ДНК, но нужно амплифицировать не его, а то, что его окружает.
• ПЦР длинных фрагментов. В ряде случаев требуется нужно амплифицировать очень длинные фрагменты – более 5 нуклеотидов. В этом случае используется отдельная методика ПЦР длинных фрагментов, которая предполагает две полимеразы.
• Этот вариант диагностики предполагает полимеразную цепную реакцию случайных полиморфных фрагментов ДНК. Используют подобную процедуру в тех случаях, когда необходимо различить сходные геномы. Применяется небольшой праймер, который может гибридизироваться со случайными участками генома.
• Метилспецифичная ПЦР. Такой вариант применяется в целях исследования различных генов. Например, для регуляции процессов старения или канцерогенеза.
• Твердофазная ПЦР. Вариант диагностики, который используется для получения ДНК-микрочипов. Достаточно специфичный способ, отличающийся сложным типом реакции.

Материал для ПЦР-исследования

Материалом, с помощью которого можно обнаружить чужеродную РНК или ДНК, могут служить различным биологические жидкости:

• Цельная кровь, плазма или сыворотка. Используется для ПЦР-анализа на вирус гепатита В, С, D, G, герпес, ЦМВ, ВИЧ, исследование генов человека.
• Моча. Часто исследуется при инфекционных поражениях мочеполовой системы у мужчин у женщин.
• Мокрота. Служит для диагностики туберкулеза, реже – респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза.
• Жидкости организма. Это может быть секрет простаты, слюна, мазок из носа, спинномозговая жидкость, околоплодные воды, суставная жидкость и т. д. Каждый вариант материала используется с учетом показаний.
• Эпителиальный мазок со слизистых оболочек. Часто используется для диагностики заболеваний, передающиеся половым путем: гонореи, хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомониаза и т. д.
• Биопсия. В этом случае используется биопсия желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления геликобактериальной инфекции.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Отдельный вопрос связан с возможными ошибками в результатах тестирования. Действительно, есть риск получения неточных данных, однако такие ошибки обусловлены несколькими факторами:

• Для ложноотрицательных результатов –это нарушение техники выполнения анализа.
• Для ложноположительных –случайное совпадение нуклеотидов или реактивов, используемых для исследования, с ДНК возбудителя.

Кроме этого, стоит учитывать, что выявление микроорганизма не всегда говорит о том, что он послужил причиной инфекции. Поэтому результаты анализа должны интерпретироваться только врачом.

Как подготовиться

Надежность результата ПЦР напрямую зависит от точности подготовки и соблюдения правил доставки материала в лабораторию. Биоматериал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективным. Основные рекомендации перед проведением анализа включают следующее:

• Мочу для исследования необходимо собрать в стерильный контейнер утром и доставить в лабораторию в течение 2 часов.
• Анализ крови следует сдавать утром натощак. Разрешено пить только чистую воду.
• При сдаче мазка из ротовой и носовой полости запрещена предварительная чистка зубов, использование антисептических растворов и лекарственных средств, также следует исключить курение.
• При диагностике ЗПППзапрещены половые контакты за 48 часов до исследования.

Особенности подготовки к ПЦР во многом зависят от конкретного анализа и материала, который требуется сдать. Поэтому лучше всего уточнять детали у врача, который назначает исследование.

Показания для анализа

Назначение такого исследования оправдано в случае подозрения на инфекционные заболевания и необходимости определения природы возбудителя. ПЦР используется в следующих целях:

• Точноеопределение возбудителя.
• Обнаружение скрытых инфекций.
• Диагностика ряда генетических заболеваний.
• Исследование биопсии, которую невозможно проверить стандартными методами.
• Обнаружениезлокачественных новообразований и лейкоза.

Часто методика применяется в различных исследованиях в области биологии и медицины. Например, для определения эффективности лекарства.

ПЦР-анализ стал универсальным методом для диагностики обширного круга заболеваний. Методика используется для обнаружения ВИЧ, гепатитов А, В и С туберкулеза и многочисленных внутриклеточных инфекций.

Лабораторное проведение

ПЦР проводится с соблюдением особой технологии, позволяющей выявить ДНК или РНК возбудителя даже в малых количествах.

• Выделение ДНК.

Сначала биологический материал проходит специальную подготовку: центрифугирование, осаждение и т. д. Это позволяет в дальнейшем отделить ДНК из исследуемого материала.

• Амплификация (увеличение количества копий ДНК).

Это самый важный этап исследования. Он выполняется в режиме термоциклирования. Именно на этой стадии проходят все процессы, определяющиеся как полимеразная цепная реакция: денатурация, отжиг и удлинение.

1. Денатурация. Первый этап представляет собой развертывание (денатурацию) нуклеиновых кислот, чтобы подготовить их к дальнейшему изучению. Реакция осуществляется путем нагревания выделенного материала до 80–90 градусов (в случае использования методики с горячим стартом).
2. Отжиг. В результате этого происходит обработка ДНК / РНК для дальнейшего получения праймеров с короткими цепями нуклеиновых кислот.
3. Удлинение. После завершения процесса отжига в реакционной смеси создаются условия для активности полимеразы. Фермент, который фокусируется на первичных молекулах (а не на исходных нуклеиновых кислотах), начинает синтез новых нитей ДНК / РНК. Они становятся копиями исходных. Удлинение выполняется многократно, иногда 30 и более раз.

• Обнаружение.

Анализ завершается оценкой результатов, которая проводится несколькими способами:

• Электрофорез в вязкой среде. ДНК / РНК электрически заряжена, поэтому движется к одному из электродов. В специальную среду добавляется ДНК-краситель. Во время электрофореза нуклеиновые кислоты движутся и образуют окрашенные кластеры. Под ультрафиолетом это выглядит как полоски разной толщины.
• Метод гибридизации. Выполняется маркировка образцов фосфором (флуорофором). При необходимости можно использовать флуорофоры для разных целей, что позволяет отметить несколько типов микроорганизмов в одном исследовании.
• В реальном времени. Если ПЦР проводится в реальном времени, то оценка результатов осуществляется непосредственно в процессе амплификации.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце желаемый материал. ПЦР в реальном времени – единственный на сегодняшний день доступный метод количественной оценки.

Особенности расшифровки

Процесс интерпретации результатов достаточно простой. В большинстве случаев для получения ответов требуется 1,5–2 дня. Возможны следующие результаты:

• Отрицательный. Указывает на то, что в диагностируемом материале отсутствует патоген. Однако такой результат не говорит об отсутствии инфекции, а только о том, что в анализируемом образце не выявлены микроорганизмы.
• Положительный. Указывает на наличие ДНК или РНК патогена в организме человека.

В некоторых случаях потребуется количественное определение возбудителя. Это, в частности, относится к заболеваниям, вызываемым условно-патогенными микроорганизмами. Связано это с тем, что такие патогены оказывают негативной влияние на организм только, если находятся в избытке. Кроме того, количественный анализ ПЦР важен для контроля терапевтической тактики и лечения вирусных инфекций (включая ВИЧ и гепатит).

В нашем медицинском центре «Адмиралтейские верфи» ПЦР-анализ выполняется с применением различных реакций. Это позволяет подобрать метод исследования с учетом предполагаемого типа возбудителя и получить на 99% точный результат. Подробнее о процедуре вы можете узнать у администраторов нашей клиники по указанному телефону!